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慢病毒介导的稳定沉默nm23-H1基因的肺癌细胞株的建立及生物学行为改变
罗猛 朱大兴 弓磊 邱小明 祖玲玲 孙丽亚 吴志浩 周清华
罗猛和朱大兴为共同第一作者
作者单位：300052 天津，天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室，天津市肺癌研究所，天津医科大学总医院（罗猛，朱大兴，弓磊，邱小明，祖玲玲，孙丽亚，吴志浩，周清华）；550002 贵阳，贵州省人民医院胸外科（罗猛）（通讯作者：周清华，E-mail: zhouqh1016@yahoo.com.cn）
本研究受国家自然科学基金重点项目（No.30430300）、国家自然科学基金项目（No.30973384）、国家“863”重大项目（No.2006AAOZA401）、国家“973”重大项目（No.2010CB529405）和中瑞国际合作项目（No.09ZCZDSF04100）资助
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1 材料与方法
2 结果
3 讨论
参考文献
【摘要】背景与目的 nm23-H1基因是重要的肿瘤转移抑制基因。前期研究发现利用化学合成的小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）抑制nm23-H1基因的表达可明显增强肺癌细胞的侵袭力。为了进一步研究nm23-H1基因沉默后的分子生物学机制，本研究利用慢病毒介导的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）建立nm23-H1基因稳定沉默的肺癌细胞株。方法 将表达特异性抑制nm23-H1基因shRNA的慢病毒转染人大细胞肺癌细胞株NL9980和肺腺癌细胞株A549，通过嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。逆转录PCR、定量PCR及Western blot法检测nm23-H1基因表达，并通过shRNA抵抗的nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验验证，侵袭小室实验检测侵袭力改变。结果 逆转录PCR、定量PCR和Western blot法检测稳定转染细胞株NL9980-99和A549-99中nm23-H1基因在mRNA和蛋白水平表达均明显降低；shRNA抵抗的nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验重现nm23-H1的正常表达；侵袭小室实验显示NL9980-99和A549-99细胞侵袭力明显增强。结论 成功建立nm23-H1基因稳定沉默的人大细胞肺癌细胞株NL9980-99和人肺腺癌细胞株A549-99，nm23-H1基因沉默后使NL9980-99和A549-99细胞的侵袭力明显增强。
【关键词】肺肿瘤；慢病毒；RNA；基因
【中图分类号】R734.2
Volume 15, Issue 3 , Pages 139-145, 20 March 2012; DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2012.03.02
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1 材料与方法
2 结果
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Lentivirus-mediated Stable Silencing of nm23-H1 Gene in Lung Cancer Cells and the Influence on Biological Behavior
Meng LUO1,2△, Daxing ZHU1△, Lei GONG1, Xiaoming QIU1, Lingling ZU1, Liya SUN1, Zhihao WU1, Qinghua ZHOU1
△Meng LUO and Daxing ZHU contributed equally to this paper.
1Tianjin Key Laboratory of Lung Cancer Metastasis and Tumor Microenvironment, Tianjin Lung Cancer Institute, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, China; 2Department of Thoracic Surgery, the Hospital of Guizhou Province, Guiyang 550002, China
Corresponding author: Qinghua ZHOU, E-mail: zhouqh1016@yahoo.com.cn
【Abstract】Background and objective The nm23-H1 gene is an important tumor metastatic suppressor gene. Our previous study showed that the downregulation of nm23-H1 gene expression using small interfering RNA (siRNA) in NL9980 lung cancer cells greatly enhanced their invasiveness. To further explore the molecular mechanisms after nm23-H1 gene knockdown, we established transgene NL9980 and A549 lung cancer cell lines with stable nm23-H1 gene silencing through the lentivirus-mediated short hairpin RNA (shRNA) method. Methods The human large cell lung cancer NL9980 and human lung adenocarcinoma A549 cells were transfected with shRNA lentiviral particles specific for the nm23-H1 gene, and were then selected through puromycin. Puromycin-resistant clones were generated and screened using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR), and Western blot analysis. shRNA rescue experiments were performed to restore the nm23-H1 gene expression in the shRNA-expressing cells. Invasiveness was determined through a Boyden chamber assay. Results The puromycin-resistant clones (NL9980-99 and A549-99) showed very low levels of nm23-H1 mRNA and protein expression under RT-PCR, qPCR, and Western blot analysis. Meanwhile, the shRNA rescue experiment restored the nm23-H1 expression in the NL9980-99 and A549-99 cells detected by Western blot. Downregulation of nm23-H1 gene expression enhanced the invasiveness of the NL9980-99 and A549-99 cells compared with the controls. Conclusion The lung cancer cell lines NL9980-99 and A549-99 with stable nm23-H1 gene silencing were successfully established and their invasiveness was greatly increased after nm23-H1 gene knockdown.
【Key words】Lung neoplasms; Lentivirus; RNA; Genes
This work was supported by the grants from the Key Project from National Natural Science Foundation of China (to Qinghua ZHOU)(No.30430300), National Natural Science Foundation of China (to Zhihao WU)(No.30973384), National 863 Program (to Qinghua ZHOU)(No.2006AAOZA401), National 973 Program (to Qinghua ZHOU)(No.2010CB529405) and China-Sweden Cooperative Foundation (to Qinghua ZHOU)(No.09ZCZDSF04100).
肿瘤侵袭转移是一个多基因调控、多阶段、多步骤发生的复杂过程，也是导致肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。nm23-H1基因是第一个被发现的重要的肿瘤转移抑制基因，它的结构和功能的异常与癌细胞的侵袭和转移能力密切相关[1-5]。在前期工作中将化学合成的siRNA瞬时转染低转移的人大细胞肺癌细胞株NL9980以抑制nm23-H1基因的表达，研究发现NL9980细胞的侵袭力明显增强[6]。但化学合成的siRNA介导的基因沉默只能维持较短的时间（5 d-7 d），为了更深入地研究nm23-H1基因沉默后对肺癌细胞侵袭转移机制的影响，本研究利用慢病毒介导的shRNA技术，转染人大细胞肺癌细胞株NL9980和肺腺癌细胞株A549，建立nm23-H1基因稳定沉默的细胞株，并观察其体外侵袭力的改变，为进一步研究nm23-H1的功能、生化作用机制奠定基础。
1 材料与方法
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1 材料与方法
2 结果
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参考文献
1.1 材料
人大细胞肺癌细胞株NL9980由本实验室建立。pcDNA3.1（+）表达载体为本实验保存。A549肺腺癌细胞株购自美国ATCC。RPMI-1640、小牛血清购自美国Gibco公司。非靶标shRNA对照慢病毒颗粒（non-targeting shRNA, SHC002V）和特异性抑制nm23-H1基因的shRNA慢病毒颗粒（nm23-H1-shRNA；Clone ID：NM_000269.x-99s1c1、NM_000269.x-182s1c1和NM_000269.x-183s1c1）、嘌呤霉素和聚凝胺购自美国Sigma公司。克隆环购自美国Corning公司。M-MLV逆转录酶、dNTP mix、RNase抑制剂、随机引物、DNA Marker购自TAKARA公司。总RNA提取试剂Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司。引物、Gold view核酸染料购自北京赛百盛公司。SYBR GREEN Master Mix、7500实时定量PCR系统购自美国ABI公司。nm23-H1鼠单抗（货号：SC-56928）购自美国Santa Cruz公司，β-actin鼠单抗（货号：A5441）购自美国Sigma公司。Boyden小室购自美国MiliPore公司。
1.2 方法
1.2.1 shRNA构建、慢病毒包装 慢病毒载体为pLKO.1-puro，由U6启动子引导shRNA的合成，并具有嘌呤霉素抗性筛选标记。将特异性靶向nm23-H1（NM_0 0 0 2 6 9 . 2 ）mRNA不同序列（NM_0 0 0 2 6 9 .x-99s1c1：GCGTACCTTCATTGCGATCAA、NM_000269.x-182s1c1：TCCGCCTTGTTGGTCTGAAAT和NM_000269.x-183s1c1：CCGCCTTGTTGGTCTGAAATT）的21 bp反向互补发夹序列克隆入pLKO.1-puro载体，并包装生产慢病毒，病毒滴度为106 TU，购自Sigma公司。
1.2.2 细胞培养、慢病毒转染和克隆细胞株筛选 转染前1天将2×105个NL9980和A549细胞铺板（6孔板），第2天细胞融合度为50%-60%，每孔加入含终浓度为8μg/mL的聚凝胺和慢病毒50 μL转染。转染24 h后加入嘌呤霉素1 μg/mL（选择浓度由杀菌曲线确定）。每隔2 d-3 d观察细胞情况，更换选择培养基。2周左右开始有克隆生长。克隆环方法挑取单克隆细胞入24孔板，90%-100%融合度后转入培养瓶扩增，鉴定，保种。
1.2.3 逆转录和定量PCR检测nm23-H1基因表达 根据总RNA提取试剂盒说明书提取RNA ，并进行逆转录PCR 。逆转录nm23-H1 引物： Forward ：5′CAAGTGCTGCGAACCACG3′； Reverse： 5 ′GACCAACAAGGCGGAATC3′ ， 扩增长度为420 bp 。参照基因GA PDH引物序列： Forward ：5′ATGGGGAAGGTGAAGGTCG3 ′ ； Reverse ： 5 ′GGGGTCATTGATGGCAACAATA3′，扩增长度为108 bp。PCR扩增条件为：94 oC、3 min，94 oC、30 s，55 oC、30 s，72 oC、2 min，30个循环；72 oC、5 min。取PCR产物10 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。nm23-H1定量PCR引物：Forward：5′AAAGGATTCCGCCTTGTTGGT3′；Reverse：5′GCCCTGAGTGCATGTATTTCAC3′，扩增长度为124 bp。定量PCR条件为：50 °C、2 min、1个循环；95 °C、10 min、1个循环；95 °C、15 s，60 °C、1 min，40个循环。做熔解曲线检测。2-ΔΔCT法计算基因表达差异[7]。
1.2.4 Western blot印迹检测nm23-H1表达的变化 细胞裂解后提取总蛋白，BCA方法测细胞蛋白浓度后进行12% SDS-PAGE电泳。100 V转膜1 h，抗nm23-H1和β-actin一抗4 oC孵育过夜，洗膜后室温二抗1 h。ECL显影。
1.2.5 shRNA抵抗nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验 根据shRNA（NM_000269.x-99s1c1:GCGTACCTTCATTGCGATCAA）序列设计nm23-H1基因shRNA 抵抗序列，下划线标记为突变碱基，该突变为沉默突变，不改变nm2 3 -H1氨基酸编码序列。突变引物：Forward：5′CGGATCCATGGCCAACTGTGAGCGAACATTTATCGCCATCAAACCA3′；Reverse: 5′GCTCTAGATCATTCATAGATCCAGTTCTGA3′。表达载体为pcDNA3.1（+）。PCR突变构建shRNA抵抗nm23-H1基因重组质粒。脂质体法将shRNA抵抗nm23-H1基因重组质粒3 μg转染稳定沉默nm23-H1基因表达的肺癌细胞株NL9980-99和A549-99，48 h后收获细胞做Western blot检测。
1.2.6 侵袭小室实验检测侵袭力改变 每个上室加300 μL无血清的RPMI-1640进行ECM胶水化1.5 h，下室加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640；然后将实验组和对照组细胞接种于Transwell 6孔板的上室中，每孔接种细胞5×105，每组设3个平行孔。在细胞培养箱孵育48 h，对下室细胞消化后细胞计数，以穿过膜的细胞数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0软件分析系统处理结果，计量资料采用Mean±SD表示，应用t检验分析数据。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
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2 结果
3 讨论
参考文献
2.1 nm23-H1基因稳定沉默细胞系mRNA和蛋白表达水平的检测
人大细胞肺癌细胞株NL9980细胞用慢病毒介导的nm23-H1 shRNA转染、筛选后，Western blot检测3个shRNA （Clone ID: NM_000269.x-99s1c1,NM_000269.x-182s1c1和NM_000269.x-183s1c1）均获得很好的nm23-H1基因沉默效果，以shRNA（NM_000269.x-99s1c1）最为明显，而非靶向干扰序列则对nm23-H1的表达没有抑制作用。故在A549肺癌细胞筛选实验中只选用shRNA（NM_000269.x-99s1c1）病毒颗粒作转染，并将nm23-H1基因稳定沉默的人大细胞肺癌细胞株NL9980和肺腺癌细胞株A549命名为NL9980-99和A549-99，将非靶标（non-target）对照细胞株命名为NL9980-non和A549-non。RT-PCR结果显示与对照细胞株相比NL9980-99细胞nm23-H1基因含量明显降低（图1A），A549-99细胞株实时定量PCR结果显示nm23-H1基因mRNA表达水平明显降低（P=0.008,501）（图1B），Western blot结果均证实nm23-H1蛋白表达明显抑制（图1C，图1D）。
2.2 shRNA抵抗nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验
将shRNA抵抗nm23-H1基因重组质粒转染稳定沉默nm23-H1基因表达的肺癌细胞株NL9980-99和A549-99，48 h后收获细胞做Western blot检测，显示恢复nm23-H1的正常表达（图2A，图2B）。
2.3 nm23-H1 基因表达抑制后侵袭力改变
Boyden小室实验检测发现nm23-H1基因稳定沉默后，NL9980-99细胞和A549-99细胞体外侵袭能力明显增强，与对照组NL9980、NL9980-non和A549、A549-non细胞比较有统计学差异（P<0.01），提示nm23-H1基因稳定沉默促进肺癌细胞的侵袭能力（图3A，图3B）。
图 1 RT-PCR、定量PCR及Western blot检测结果。A：RT-PCR检测nm23-H1 mRNA在NL9980-99细胞中的表达，相对内参为GAPDH，与对照相比nm23-H1含量明显降低；1：NL9980；2：NL9980-99；B：qRT-PCR检测nm23-H1 mRNA在A549-99细胞中的表达，相对内参为GAPDH（P <0.01）；C：Western blot检测nm23-H1蛋白在 NL9980-99细胞中的表达，与对照相比表达量明显降低；D：Western blot检测nm23-H1蛋白在A549-99细胞中的表达，与对照相比表达量明显降低。
Fig 1 Results of RT-PCR, qRT-PCR and Western blot. A: The results of nm23-H1 mRNA RT-PCR, nm23-H1 expression greatly reduced compared with GAPDH; M: DNA marker; 1: NL9980; 2: NL9980-99; B: The results of nm23-H1 mRNA qRT-PCR, analysis of expression normalized with GAPDH (P <0.01); C: The results of nm23-H1 expression in NL9980-99 cells by Western blot, nm23-H1 expression greatly reduced compared with β-actin; D: The results of nm23-H1 expression in A549-99 cells by Western blot, nm23-H1 expression greatly reduced compared with β-actin.
图 2 NL9980-99和A549-99细胞shRNA抵抗nm23-H1基因重组质粒转染拯救实验。A：NL9980-99细胞nm23-H1 基因shRNA抵抗拯救实验，与对照组相比nm23-H1 基因重组质粒转染组重现nm23-H1的正常表达；B：A549-99细胞nm23-H1 基因shRNA抵抗拯救实验，与对照组相比nm23-H1基因重组质粒转染组重现nm23-H1的正常表达。
Fig 2 shRNA rescue experiments in NL9980-99 and A549-99 cells. NL9980-99 and A549-99 cells were transfected with vector containing shRNAresistant nm23-H1 cDNA to rescue the expression of nm23-H1. A: shRNA rescue experiments in NL9980-99 cells analyzed by Western blot; B: shRNA rescue experiments in A549-99 cells analyzed by Western blot.
图 3 Boyden小室检测NL9980-99和A549-99细胞侵袭力的改变。A：NL9980-99细胞与对照相比，侵袭力明显增强（P <0.01）；B：A549-99细胞与对照 相比，侵袭力明显增强（P <0.01）。
Fig 3 Boyden chamber assay of NL9980-99 and A549-99 cells. A: Boyden chamber assay of NL9980-99 cells, compared with the control (P <0.01); B: Boyden chamber assay of A549-99 cells, compared with the control (P <0.01).
3 讨论
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1 材料与方法
2 结果
3 讨论
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nm23基因是第一个被发现的肿瘤转移抑制基因[1]。迄今为止，人类nm23基因已报道了8个亚型，即nm23-H1至nm23-H8，其中nm23-H1基因与肿瘤侵袭转移的关系最密切，已得到人们的普遍重视[8]。nm23-H1具有二磷酸核苷激酶（nucleotide diphosphate kinase, NDPK）活性[9]、组氨酸蛋白激酶活性[10]和3’-5’核酸外切酶活性[11]。近期研究[12]显示nm23-H1参与了紫外线诱导的DNA损伤修复过程，并可能与紫外线诱发的黑色素瘤的形成有关。Conery等[13]报道nm23-H1表达的缺失可以导致细胞染色体不稳定，从而参与肿瘤的形成过程。尽管20多年来国内外做了大量的研究，nm23-H1基因抑制肿瘤侵袭转移的分子机制还未完全阐明。
我们的前期研究[14-16]显示nm23-H1基因的低表达和杂合性缺失与人肺癌的高转移性有密切关系。将野生型nm23-H1基因转染人高转移大细胞肺癌细胞株L9981可以逆转L9981的侵袭、转移表型[17]。将化学合成的siRNA瞬时转染低转移的人大细胞肺癌细胞株NL9980抑制nm23-H1基因的表达，NL9980细胞的侵袭力明显增强；通过基因芯片检测发现基因表达谱发生明显变化，表达上调的基因有707个，下调的有373个。其中上调基因主要有肿瘤转移相关基因、细胞增殖、细胞周期、生长发育（包括胚胎发育和神经系统发育）以及细胞运动迁徙相关基因；下调基因包括肿瘤抑制基因、细胞骨架相关基因等 [6]。上述研究结果说明nm23-H1基因可能是肿瘤侵袭转移的上游调控基因，但nm23-H1基因调控的关键下游分子或靶点尚需进一步研究确定。
为了进一步研究这些功能改变及相关的分子机制，需要建立稳定沉默nm23-H1基因的肺癌细胞株。RNA干扰技术现已成为研究基因功能的重要工具[18]，但化学合成的siRNA介导的基因沉默只能维持较短的时间（5 d-7 d），而且通常转染的效率较低[19]。因此，通过载体介导的RNA干扰就成为了选择。近年来，由于慢病毒技术的发展及其自身的优点，如免疫原性低、感染范围广，可以高效整合到宿主细胞基因组稳定产生siRNA，使得慢病毒介导的RNA干扰成为稳定基因沉默的最常用选择，并可克服化学合成siRNA的缺点[20]。
本研究通过慢病毒介导的特异性靶向nm23-H1基因shRNA，转染人大细胞肺癌细胞株NL9980和肺腺癌细胞株A549，经过嘌呤霉素筛选获得了稳定沉默nm23-H1基因表达的肺癌细胞株NL9980-99和A549-99。mRNA和蛋白水平检测均证实nm23-H1的表达明显降低，并通过转染shRNA抵抗的nm23-H1表达载体，恢复nm23-H1的表达。该拯救实验证实我们所建立的NL9980-99和A549-99细胞中nm23-H1基因沉默是由于RNA干扰机制降解了nm23-H1基因mRNA所致，而不是脱靶效应（offtarget effect）[19]。通过Boyden小室实验观察到nm23-H1基因沉默后，人大细胞肺癌细胞株NL9980和人肺腺癌细胞株A549细胞的侵袭力明显增强，差异具有统计学意义（P<0.01）。不同肺癌细胞株nm23-H1基因沉默后具有相似的侵袭力改变，逆向证明了nm23-H1基因肿瘤转移抑制的功能。以上结果显示本课题组成功建立了nm23-H1基因稳定沉默的人大细胞肺癌细胞株NL9980-99和肺腺癌细胞株A549-99，为更深入研究nm23-H1的功能、生化作用机制奠定了基础。
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1 材料与方法
2 结果
3 讨论
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